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標簽：熒光定量 PCR PCR 試劑 實時熒光定量 PCR 耗材
所謂實時熒光定量 PCR 技術(shù) ，是指在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR 進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。以下便是天津本生生物就熒光定量 PCR 原理的簡要說明，一起來看下：
檢測方法：
1.SYBRGreenⅠ法：在 PCR 反應(yīng)體系中，加入過量 SYBR 熒光染料，SYBR 熒光染料特異性地摻入 DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR 產(chǎn)物的增加*同步。SYBR 定量 PCR 擴增熒光曲線圖 PCR 產(chǎn)物熔解曲線圖 (單一峰圖表明 PCR 擴增產(chǎn)物的單一性)
2.TaqMan 探針法：探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR 擴增時，Taq 酶的 5』-3』外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物的形成*同步。
1. 熒光閾值 (threshold) 的設(shè)定 PCR 反應(yīng)的前 15 個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省 (默認) 設(shè)置是 3-15 個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的 10 倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-152. Ct 值與起始模板的關(guān)系每個模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下。Ct =-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n 為擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0 為初始模板量，Ex 為擴增效率，N 為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量。起始拷貝數(shù)越多，Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代 Ct 值。因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
實時熒光定量 PCR 所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：
1. TaqMan 熒光探針：PCR 擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR 擴增時，Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成*同步。而新型 TaqMan-MGB 探針使該技術(shù)既可進行基因定量分析，又可分析基因突變 (SNP)，有望成為基因診斷和個體化用藥分析的當選技術(shù)平臺。
2. SYBR 熒光染料：在 PCR 反應(yīng)體系中，加入過量 SYBR 熒光染料，SYBR 熒光染料非特異性地摻入 DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR 產(chǎn)物的增加*同步。SYBR 僅與雙鏈 DNA 進行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定 PCR 反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標：是一種在 5 和 3 末端自身形成一個 8 個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導(dǎo)致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR 產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定 DNA 序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。
1. 傳統(tǒng)定量 PCR 方法簡介：
1) 內(nèi)參照法：在不同的 PCR 反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在 PCR 產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。
2) 競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增 (其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內(nèi)切酶消化 PCR 產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。3)PCR-ELISA 法：利用 digaoxin 或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合，再加入抗 digaoxin 或生物素酶標抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的 PCR-ELISA 法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。
2. 內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的作用由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測，即 PCR 到達平臺期后進行檢測，而 PCR 經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在 96 孔 PCR 儀上做 96 次重復(fù)實驗，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
3. 內(nèi)標對定量 PCR 的影響若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標，則 PCR 反應(yīng)變?yōu)殡p重 PCR，雙重 PCR 反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標，但仍然只是一種半定量的方法。 實時熒光定量 PCR 技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品 Ct 值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。
因此，實時熒光定量 PCR 無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1)Ct 值的重現(xiàn)性 PCR 循環(huán)在到達 Ct 值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期 (對數(shù)期)，此時微小誤差尚未放大，因此 Ct 值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的 Ct 值是恒定的。
2)Ct 值與起始模板的線性關(guān)系由于 Ct 值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量 PCR 是一種采用外標準曲線定量的方法。外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標準曲線的實時熒光定量 PCR 是迄今為止定量準確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。 各級各類醫(yī)療機構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。由于 qPCR 是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨到優(yōu)
產(chǎn)品優(yōu)勢：
本生生物代理實驗室耗材,PCR 耗材品種全，可替代儀器原廠耗材，性價比高，質(zhì)量穩(wěn)定，對用戶可以節(jié)省實驗成本。
適應(yīng)客戶：
醫(yī)院檢驗科 PCR 實驗室，中心實驗室，肝病中心；第三方檢測機構(gòu)，科研院所，大專院校，制藥廠，試劑生產(chǎn)廠家，疾控中心，檢驗檢疫。
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