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天津本生—PCR技術(shù)原理、實驗步驟和應用
實驗目的
1.掌握聚合酶鏈式反應的原理。
2.掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。
二、實驗原理
PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction，PCR)是由美PECetus公司的KaryMullis在1983年(1993年獲諾貝爾化學獎)建立的。這項技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時反應就將特定的DNA的片段擴增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單核酸片段的技術(shù)在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義，大地推動了生命科學的研究進展。它不僅是DNA分析常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應用價值。
PCR可以被認為是與發(fā)生在細胞內(nèi)的DNA復制過程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補DNA的片段。細胞中DNA的復制是個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應，基本原理與細胞內(nèi)DNA復制相似，但反應體系相對較簡單。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構(gòu)成：
①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應做準備;
②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;
③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。
重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
三、實驗試劑與器材
模板DNA、2.5mmol/LdNTP
TaqDNA聚合酶(5U/μL)、SSR引物
10×buffer、15mmol/LMg2+、ddH2O
PCR儀、移液槍、PCR板
四、實驗步驟
1、配制20μL反應體系，在PCR板中依次加入下列溶液：
模板DNA2μL
引物11μL
引物21μL
dNTP1.5μL
MgCl22μL
10×buffer2μL
ddH2O10μL
Taq酶0.5μL
2、設置PCR反應程序。
3、上樣，啟動反應程序。
4、擴增產(chǎn)物的電泳檢測。
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